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第八章 枸杞糖肽及枸杞多糖的科学研究（第3页）

研究结果显示，与安慰剂组相比，干预结束后LBP组的24项汉密尔顿抑郁量表（24itemsHamiltonDepressionScale，HAMD-24）改善更大，缓解率更高（HAMD-24≤7分）。干预前后两组间的贝克抑郁量表II（BeckDepressionInventory-II，BDI-II）、匹兹堡睡眠质量指数（PittsburghSleepQualityIndex，PSQI）、凯斯勒心理痛苦量表（KesslerPsychologicalDistressScale，Kessler）和儿童焦虑相关情绪障碍筛查量表（ScreenforChildAnxiety-RelatedEmotionalDisorders，SCARED）评分变化没有统计学差异。

以上结果表明，LBP可以改善青少年的抑郁症状。此外，LBP安全性高、无明显不良反应。

二、枸杞糖通过降低机体的炎症反应改善青少年抑郁症状研究团队最近的双盲、随机、安慰剂对照试验（RCT）发现枸杞多糖（LBP）可以明显地改善青少年的抑郁症状。在此基础上，研究团队进一步探索LBP的抗抑郁效应是否与其抗炎作用有关。

在这项为期6周的RCT试验中，研究团队在干预前后分别测量了LBP干预组（LBP干预，n=14）或对照组（安慰剂，n=10）外周血样本中常见的细胞因子水平。使用独立的t检验比较两组间细胞因子水平的变化。基于网络的分析用于评估干预措施的全身免疫反应。两组间的人口学资料和临床特征没有统计学差异。与安慰剂组相比，干预结束后LBP组IL-17A因子浓度降低更加明显（t=-2。25，P=0。04）。此外，网络水平分析表明，LBP干预降低了细胞因子之间的相关性和连通性（Z=3。34，P＜0。01），这与LBP改善抑郁症状有关。团队的研究提示，6周持续的LBP干预可以降低机体的免疫反应，这可能与LBP抗抑郁作用有关。

第九节枸杞多糖提取纯化的研究进展植物多糖是指存在于植物中的一类多糖，根据它们在植物中的位置可以分为三种类型，包括细胞壁多糖、细胞内多糖和细胞外多糖。细胞壁多糖主要包括一些常见的多糖，如果胶、纤维素和半纤维素，而细胞内多糖包括葡聚糖、游离多糖等。而细胞外多糖则包括一些树胶等多糖。由于这些多糖来自于植物的不同部分，因此，它们通常具有不同的结构和药理特性。不同的提取方法和介质可以通过水解和破坏细胞的不同部位来溶解不同类型的多糖，从而产生具有不同功能特性的各种多糖。

枸杞多糖是一种多糖，它由多种单糖单元组成，包括葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、木糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等，通过脱水缩合以糖苷键聚合而成的高分子化合物。枸杞多糖还与少量的蛋白质、多肽、脂质等缀合，形成糖苷复合物。枸杞多糖的分子量分布在10~2300ku之间，占枸杞子干果的5%~8%。枸杞多糖属于一类水溶性的杂多糖，是一种极性大的化合物。因为水的极性最高，所以它可以最容易穿透植物组织。因此，水提取法是获取枸杞多糖的经典方法。通常，水提取的料液比为1∶10~1∶35，提取时间为2~7h，提取温度为70~100℃，提取次数为1~5次。

为了提高枸杞多糖的提取率，研究团队通过响应面法分析了水提法的温度、提取时间、料液比和提取次数对其提取率的影响。他们发现，在提取时间为5。5h，料液比为1∶31。2，提取温度为100℃，重复提取5次的条件下，多糖提取率最高，达到23。13%。此外，Dong等开发了一种微波超声偶联辅助水提取法，该方法使用95℃微波提取10min，50℃超声提取30min，并重复该过程2次。在这种条件下，枸杞多糖的提取率达到6。5%。研究团队则利用水在亚临界状态下氢键减弱、极性范围增大的特点，设计了一种超声辅助亚临界水提取枸杞多糖的方法。该团队通过响应面法优化提取温度、提取时间、料液比和超声功率这4个主要参数，得到了亚临界温度110℃，提取时间60min，料液比1∶25，提取压力5MPa和超声功率140W的最优提取条件。在该条件下，LBP的提取率为4。44%，显著高于超声提取（2。99%）和回流提取（3。44%）2种方法。

此外，研究团队对比了回流水提取、超声水提取、亚临界水提取和超声辅助亚临界水提取4种方法对枸杞多糖提取率及化学成分含量的影响。研究发现，亚临界水可以提取更多极性偏小的蛋白和多酚类物质，而超声辅助亚临界水提取得到的枸杞多糖提取率以及蛋白、多酚的含量是回流水提取的2倍。

热水提取（HWE）虽然简单、安全、经济，被广泛用于多糖的提取，但对细胞的渗透性较弱，只能溶解部分细胞内多糖。因此，在提取过程中通常采用酸提取（ACE）和碱提取（ALE）来提高多糖的释放和溶解度。这些方法主要是通过破坏植物细胞壁的结构来促进多糖的溶解。酶法提取（EAE）的提取机制是通过酶的水解作用破坏植物细胞壁中的纤维素，促进水溶性多糖的释放。虽然这种方法具有较高的选择性，但是需要专业的设备和技术，成本较高。

因此，为了获得更加丰富的枸杞多糖结构，必须探索新的提取方式。为提高枸杞多糖的提取率，可以在提取溶剂中添加其他物质，改变溶剂的理化性质或增加溶剂的穿透性，这已经成为一种策略。

研究团队利用木瓜蛋白酶和纤维素酶提取枸杞多糖，并通过正交实验设计优化了两种添加物的浓度。他们发现，在提取温度为60℃，pH=5。0，提取时间为91min时，将枸杞子质量的2%纤维素酶和1%木瓜蛋白酶加入后，枸杞多糖的提取率为6。81%。Zhou等在提取枸杞多糖的过程中添加了一定比例的纤维素酶、木瓜蛋白酶和淀粉酶。虽然多糖的提取率没有明显增加，但是获得了植物细胞壁多糖-果胶，该多糖具有显著的抗阿尔茨海默病疗效。

研究团队开发了一种超声辅助酶解提取法，提取温度为60℃，pH=4。6，超声功率为80W，纤维素酶的添加量为枸杞子质量的1。5%，提取20min，枸杞多糖的提取率为6。31%。Zhou等系统考察了热水提取、热水酸提、热水碱提、温水酸提、温水碱提以及热水提取偶联碱提取、酸提取偶联碱提取等多种提取方式对枸杞多糖提取率及化学结构的影响。研究结果表明，不同的提取方式得到的枸杞多糖在多糖提取率、总糖含量、总蛋白含量及单糖组成方面有明显不同。同时，发现碱提取的多糖含有更多的中性糖和糖蛋白侧链，分子量也大于酸提取的多糖；高温提取导致糖链碎片增多，分子量比低温提取的多糖略低。

团队利用离子液体（ILs）的特性——细胞渗透性强、萃取条件温和、降解风险低、选择性高、可设计性强等，构建了一种高效提取枸杞多糖的新方法。该研究比较了在水（LBP-W）、0。1MHCl（LBP-Ac）、0。1MNaOH（LBP-Al）、0。1%酶（LBP-E）和6%离子液体（LBP-ILs）5种不同介质中提取的枸杞多糖的理化性质、结构和降血糖活性。

结果表明，5种不同介质提取所得LBP具有相似的晶体结构、红外光谱特征、三螺旋结构和热稳定性。但在化学组成、单糖组成、分子量、糖苷键组成、形貌分析和体外降血糖活性方面存在显著差异。不同的提取介质通过提取不同结构特性的多糖进而影响其生物活性。这是因为枸杞多糖在不同提取介质体系中的物理和化学变化诱导结构和生物活性的变化。其中，LBP-ILs对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和AR均表现出显著的抑制活性，明显优于其他LBP。这可能与单糖组成中Gal和Ara含量最高、多孔结构丰富、三螺旋结构有关。因此，综合比较这5种LBP的理化性质和生物活性，表明ILs是从枸杞中提取降血糖多糖的一种很有前途的介质，有望应用在其他药用植物中提取多糖。

在枸杞多糖的提取过程中，可能会夹带蛋白质和色素等杂质，这些杂质会对其化学结构和功能特征的测定造成严重干扰。因此，在进行离子交换树脂、葡聚糖凝胶柱层析分离之前，需要对上述杂质进行去除。传统的蛋白质去除方法包括Sevage法、三氟三氯乙烷（C2Cl3F3）法、三氯乙酸（TCA）法和酶法。值得注意的是，这些方法会对多糖的化学结构和生物活性造成损害。

为了解决这个问题，Shi等设计并合成了一种单宁酸-FeIII和Fe3O4磁性纳米粒子复合物吸附剂（Fe3O4@TA-FeIII，简称FTFNPs）。该材料通过单宁酸的氢键与静电作用以及FeIII对蛋白质的螯合作用特异性吸附枸杞多糖中的蛋白质。同时，借助Fe3O4磁性纳米粒子的磁性快速分离，使得FTFNPs能够在10min内达到对蛋白质的吸附平衡。该方法对LBPs表现出良好的去蛋白性能，蛋白脱除率和多糖保留率分别为96。2%和98。1%。相比于传统的Sevage法，该方法不含任何有毒有机试剂，并且对多糖的化学结构和生物活性没有损伤。这项研究还展示了FTFNPs的良好便捷性和普适性。

枸杞多糖是一种重要的生物活性成分，但多糖的颜色对其应用和销售造成了一定的限制，因此需要进行脱色处理。目前，常用的枸杞多糖脱色方法主要有H2O2氧化法、活性炭吸附法和离子交换树脂法。然而，这些方法都存在一定的问题。H2O2氧化会导致多糖的结构发生变化，从而降低多糖的生物活性和构效关系。活性炭无法特异性识别色素和多糖，不仅导致多糖的保留率下降，而且活性炭不能重复使用，增加脱色成本。离子交换树脂在脱色方面表现出一定的优势，但碱性离子交换树脂会吸附酸性多糖，而后者普遍具有显著的生理活性，这可能导致多糖的生物活性受到影响。因此，在选择脱色方法时，需要综合考虑多种因素，如脱色效果、多糖的生物活性和成本等，以选择最适合的方法。

为了脱除枸杞多糖中的色素，研究团队考察了9种大孔吸附树脂的性能，以枸杞多糖保留率和色素脱除率为指标。结果表明，D318树脂在上样浓度为3mgmL，树脂用量为0。12gmL，pH=7，处理3h后多糖的保留率和脱色率分别为85。49%和67。32%。虽然脱色率相对其他脱色方法偏低，但该技术多糖保留率高，不会损伤多糖的结构，易于工业化推广。

研究团队还通过采用溶胶-凝胶法制备了一种活性炭固定TiO2的光催化剂，并将其装填于自行研制的冷电弧-光催化-吸附集成反应器中，用于枸杞多糖的脱色。结果显示，脱色率为80。9%，多糖保留率为80。4%。研究人员发现了一种基于石墨烯纳米材料的脱色方法，可以可持续无损伤地脱除枸杞多糖中的色素。该材料以氧化石墨烯为前驱体，通过胺化得到了氨基氧化石墨烯材料NH2-rGO。NH2-rGO具有丰富的sp2杂化碳域和高比表面积，可以和目标分子形成π-π相互作用，从而在5min内高效快速地脱除LBP中的色素，脱色率高达98。72%，多糖保留率高达95。62%。相较于传统的H2O2氧化法和活性炭吸附法，NH2-rGO的脱色效率和多糖保留率更高，对LBP的化学结构和生物活性没有任何影响，并且还具有良好的重复性。研究团队开发了一种新技术，利用双水相结合高速剪切（TSE-ATPS）高效提取LBP并同时除杂。该技术相比于热水提取法（HWE），LBP的提取率提高了108。5%；相比于超声辅助双水相提取法（UAE-ATPS），LBP的提取率提高了93。8%。利用红外光谱、离子色谱等手段对其结构官能团和单糖组成进行了表征。结果表明，提取方法、盐的种类、组成和配比以及双水相体系上下相的差异对提取所得LBP的结构和单糖组成均有显著影响。同时，利用相图解释了双水相对LBP的提取分离机理。为评价LBP在大健康产业中的潜在价值，采用体外方法评价了LBP的抗氧化活性。结果表明，相比于热水提取法，该技术在提高LBP提取效率的同时，保留了所得LBP的抗氧化活性。因此，将醇盐双水相体系的高传质效率和优异的相分离能力与TSE技术相结合，在常温条件下加快了目标物质和共存杂质分别向上相和下相的选择性转移，从而实现了LBP同步高效提取活性多糖和除杂。这种从中药复杂体系中同步高效提取活性多糖和除杂的新技术，在枸杞多糖及其中药多糖的产业化方面具有重要的应用价值。

第十节枸杞多糖的超滤膜过滤技术研究枸杞多糖是一种生物大分子，结构复杂。其生物活性与化学结构和分子量密切相关，因此选择性纯化过程变得非常重要。传统的凝胶渗透色谱、离子交换色谱和分步沉淀方法能将多糖初步分成不同分子量大小的片段，但这些方法存在诸如难以产业化推广、生产和维护成本昂贵以及潜在改变多糖结构的缺陷。尤其是分步乙醇沉淀方法，虽然具有普适性，但近年来研究发现，多糖溶液中加入有机低级醇时，由于分子内氢键的增强，多糖分子开始脱水，进而发生构象转变和重新组装，这为多糖本身结构、活性及其构效关系的研究带来了阻碍。

超滤膜过滤技术是一种利用机械筛分原理进行分离的方法，能够选择性地从溶液中获取目标分子量的溶质。溶质分子能否透过超滤膜，完全取决于其直径和超滤膜孔径。超滤膜分离技术具有分离效率高、能耗低、程序快速、操作简便等优点，通常用于蛋白质等生物大分子的分离。由于没有相转移过程，超滤膜过滤技术主要依赖机械筛分原理，因此对于维持提取成分的原始化学结构和生物活性至关重要。

研究团队基于分子排阻的原理，利用不同分子量的膜元件，构建了一种串联超滤混合膜过滤系统，旨在选择性纯化多糖的特定片段，或将多糖分离纯化成不同的分子量片段，便于精准地活性筛选识别或工业高效靶向利用。

该系统具有以下优点：

一是可以根据实际需求更换不同截留分子量的膜元件组成的模块。在相同分子量膜元件组成的模块中，可以按照对效率的需求将相同分子量膜元件进行多个串联。整个膜分离装置的膜元件，除按照从大到小顺序排列外，其余都可以任意更换。这大大提高了膜分离装置的普适性和便捷性。

二是所使用的不同截留分子量膜元件串联分离系统可以按照需求构建实验室型、中试型和生产型系统。这使得从实验室小试到中试放大再到产业化的无缝技术对接变得容易。

三是整个工作过程都是多糖的水溶液进行基于分子排阻的机械筛分。这有效避免了使用易燃易爆的有机低级醇溶剂，大大提高了操作的安全性。

四是如果在前期多糖的提取阶段进行温度控制，那么整个分离过程中温度精准可控。这最大限度地保留了多糖的活性结构和热敏性有效成分。将该系统用于枸杞多糖的分离中，并对获得的不同分子量的枸杞多糖的理化性质和抗氧化能力进行了初步评价。研究结果可以为膜分离技术在多糖分离中的应用提供理论依据。